Đã có nhiều công trình nghiên cứu về các đặc điểm hóa sinh liên quan đến độc tính của Aeromonas hydrophỉla, một vi khuẩn thường gây bệnh cho cá, ở Việt Nam chưa có các công trình tương tự. Việc nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa như hàm lượng, thành phần, hoạt độ và khả năng dung giải hồng cầu của protein ngoại và nội bào của vi khuẩn gây bệnh đốm đỏ ở cá trắm cỏ nhằm góp phần lý giải cơ chế gây bệnh và tìm kiếm các biện pháp phòng bệnh bằng những thử nghiệm điêu chê vaxcin dự phòng.
I. Nguyên liệu và phương pháp
Bốn chủng vi khuẩn (chủng I, II, III và IV) phân lập từ các mô cơ, gan, thận của cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon ỉdellus) bị bệnh đốm đỏ do TS. Bùi Quang Tề (Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I) cung cấp.
Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường Nutrient Broth (code 64064 của hãng Sigma) để lấy sinh khối.
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford. Protein được điện di trên gel PAGE- SDS. Bản gel được nhuộm bạc theo phương pháp Heukeshoven.
Hoạt độ protease được xác định bán định lượng bằng phản ứng khuếch tán trên đĩa thạch agar 1,2% và cazein 0,2%. Hoạt độ protease được đo bằng đường kính của vòng tròn không bắt màu thuốc nhuộm.
Định lượng proteaza được xác định theo phương pháp Anson cải tiến trong đó đơn vị hoạt độ là Ì |j,mol tyrozin được enzyme phân giải từ cơ chất trong 1 phút.
Hoạt độ proteaza nội bào được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến.
Thí nghiệm về khả năng làm tan hồng cầu người và cá được thực hiện trên bản nhựa (microtitre-plate, Nunc Danmark).
II. Kết quả và thảo luận
1. Hàm lượng protein ngoại bào
Hàm lượng protein ngoại bào của các chủng vi khuẩn trong dịch sinh khối ban đầu và trong dịch kết tủa (sau khi đã thẩm tích) được trình bày trong Bảng 1.
Kết quả trên cho thấy hàm lượng protein ngoại bào của chủng vi khuẩn I là lớn nhất, tiếp đó là chủng IV và sau cùng là các chủng III và II.
2. Định tính hoạt độ protease ngoại bào của các chủng vi khuẩn
Kết quả thí nghiệm trên đĩa thạch cho thấy protease ngoại bào chủng II, IV có hoạt độ lớn hơn chủng I, III (Hình 1).
Giếng 1-4: Dịch protein ngoại bào của chủng I – IV, tương ứng.
Giếng 5: Đối chứng bằng dung dịch Nutrient Broth chưa nuôi cấy.
3. Định lượng hoạt độ protease ngoại bào của các chủng vi khuẩn
Hoạt độ protease của dịch ngoại bào của các chủng vi khuẩn được trình bày trong Bảng 2. Kết quả này cho thấy hoạt độ protease của chủng II và chủng IV là lớn hơn cả và phù hợp với kết quả phản ứng khuếch tán trên đĩa thạch.
4. Thành phần protein của các chủng vi khuẩn
Thành phần protein ngoại bào của các chủng vi khuẩn được thể hiện trên điện di đồ.
Đường chạy 1,2, 3, 4: Protein ngoại bào của chủng IV, III, II, I (tương ứng).
Hình 2 cho thấy các chủng IV, III, II (đường chạy 1,2, 3) có số lượng băng protein như nhau (6 băng), vị trí của các băng là tương đương nhau, tức là thành phần protein ngoại bào của 3 chủng này tương tự nhau. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của chủng II, IV là lớn hơn so với các chủng khác vì hoạt độ protease ở 2 chủng này cao hơn gấp bội so với chủng I và III.
Riêng chủng I có các băng khác biệt nhiều so với 3 chủng còn lại. Trên điện di đồ của chủng này (đường chạy số 4) có 5 băng rất mờ và một băng rất đậm, các băng này đều ở vị trí cao hơn so với băng đậm nhất của chủng II, III và IV. Tuy hàm lượng protein ngoại bào của chủng I cao hơn so với 3 chủng kia nhưng hoạt độ protease của chủng này lại rất nhỏ (0,3592 U). Như vậy chủng I có thể chỉ là một chủng vi khuẩn sống ký sinh trên cá tràm cỏ, ít có khả năng gây bệnh nhiễm trùng xuất huyết như các chủng II, IV hoặc có thể gây bệnh theo một cơ chế khác.
5. Khả năng làm tan hồng cầu của protein ngoại bào
Kết quả thí nghiệm về khả năng dung giải hồng cầu của các chủng vi khuẩn được thể hiện trên Hình 3a,b.
Hình 3a,b. Khả năng dung giải hồng cầu người (A, B, AB) và cá (Ca)
1: Chủng I: Khi pha loãng nồng độ dịch protein ngoại bào tới 16 lần so với dịch protein ngoại bào kết tủa (sau khi thẩm tích) thì không còn khả năng làm tan hồng cầu của người và cá.
2: Chủng II: Khi nồng độ pha loãng là 128 lần thì chỉ có hồng cầu cá bị tan còn hồng cầu người không bị tan.
3: Chủng III: Khi nồng độ pha loãng là 32 lần thì cả hồng cầu người và cá đều không bị tan.
4: Chủng IV: Khi nồng độ pha loãng là 64 lần thì cả hồng cầu người và cá cũng không bị tan.
DC: Đối chứng, thay dịch protein ngoại bào bằng dung dịch Nutrient broth chưa nuôi cấy vi khuẩn
Các kết quả này phù hợp với những kết quả xác định hoạt độ enzym protease ngoại bào ở trên và cho thấy dịch protein ngoại bào của các chủng vi khuẩn này có khả năng dung giải rất mạnh và có thể đây là nguyên nhân chính tạo nên khả năng gây bệnh xuất huyết đốm đỏ ở cá của các chủng vi khuẩn này.
6. Hàm lượng protein nội bào
Hàm lượng protein nội bào của vi khuẩn được trình bày trong Bảng 3.
Phản ứng khuếch tán trên đĩa thạch của protein nội bào cho thấy protein nội bào không phân giải cơ chất (phân tích kết quả thí nghiệm trên đĩa thạch), điều này chứng tỏ protein nội bào có hoạt tính protease rất thấp.
IV. Nhận xét
Thành phần, hàm lượng và hoạt độ protein ngoại bào của các chủng vi khuẩn khác nhau là khác nhau. Hàm lượng protein ngoại bào ở chủng I là cao nhất. Hoạt độ protein ngoại bào của chủng II là cao nhất. Protein ngoại bào của vi khuẩn chủng II và IV có khả năng dung giải hồng cầu mạnh hơn chủng I và III. Protein nội bào của các chủng này không có khả năng dung giải hồng cầu.
Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn các đặc điểm hóa sinh của vi khuẩn gây bệnh xuất huyết lở loét ở cá làm cơ sở cho việc tìm kiếm các biện pháp phòng trị bệnh này cho cá.
Theo AquanetViet
